Cuando miras al cielo azul, ¿dónde están las estrellas que ves por la noche? Están ahí, pero no podemos verlas. Una luciérnaga que revolotea por un campo es invisible para nosotros durante el día, pero por la noche podemos distinguir fácilmente sus destellos. Del mismo modo, las proteínas, los virus, los parásitos y las bacterias dentro de las células vivas no se pueden ver a simple vista en condiciones normales. Sin embargo, una técnica que utiliza una proteína fluorescente puede iluminar los mecanismos moleculares de las células como una linterna microscópica.
La primera proteína fluorescente hallada en la naturaleza procede de la medusa cristal, Aequorea victoria, donde es responsable de la luz verde emitida por sus órganos fotóforos. Se llama proteína verde fluorescente (GFP). No sabemos por qué estas medusas tienen esta característica luminosa.
Las proteínas fluorescentes absorben luz de longitudes de onda cortas, como la luz azul, y la devuelven de inmediato como luz de otro color y de mayor longitud de onda, como la verde. En Aequorea victoria, una proteína llamada aequorina produce luz azul que la GFP convierte en la luz verde emitida por los órganos fotóforos de la medusa. Esta visibilidad en condiciones estándar es extremadamente rara; la mayoría de los demás organismos tienen proteínas fluorescentes que solo son visibles cuando se iluminan con fuentes externas de luz azul.
Tras el descubrimiento de la proteína verde fluorescente de la medusa, se han hallado muchas otras proteínas fluorescentes en la naturaleza y también se han creado en el laboratorio. Ahora disponemos de un espectro de colores fluorescentes que permite ver estructuras y procesos biológicos antes invisibles con un intenso resplandor fluorescente. Con regularidad se publican muchas aplicaciones nuevas que dependen de estos colores.
Placa de Petri con colonias bacterianas que expresan proteínas fluorescentes de distintos colores.
Paul Steinbach y Roger Y. Tsien, Universidad de California en San Diego, CC BY-SA
Iluminar las técnicas de imagen
La tecnología de las proteínas fluorescentes ha propiciado muchos otros avances interesantes concebidos para mejorar la obtención de imágenes con estas moléculas luminosas.
CaMPARI es una nueva técnica, sigla de integrador ratiométrico fotoactivable modulado por calcio. Al aprovechar el hecho de que las concentraciones de calcio cambian cuando las células nerviosas envían señales, CaMPARI puede iluminar todas las neuronas que se han activado en un organismo vivo. La técnica se basa en una proteína fluorescente llamada EOS, que cambia su fluorescencia de verde a rojo. En moscas de la fruta, peces cebra y ratones, las neuronas modificadas genéticamente con CaMPARI emiten fluorescencia roja si están activas y verde si lo están menos.
Fluorescencia de CaMPARI en el cerebro de una larva de pez cebra, que muestra las neuronas activas (magenta) marcadas mientras el pez nadaba libremente.
Laboratorio Looger (HHMI/Janelia), Science, VOL 347, N.º 6223.
Antes de CaMPARI, todos los indicadores fluorescentes de calcio disponibles se iluminaban temporalmente cuando se activaba una neurona. No podían registrar el historial de activación de las neuronas ni indicar si una neurona se había activado en el pasado. Según Loren Looger, uno de los investigadores que trabajaron en el desarrollo de CaMPARI: «Lo más revolucionario de esta tecnología quizá sea que no es necesario tener el organismo bajo un microscopio durante el experimento. Así que ahora podemos visualizar la actividad neuronal en larvas de mosca que se arrastran por una placa o en peces que nadan en un recipiente».
Cerebros ampliados y transparentes
Incluso con la ayuda de la luz emitida por las proteínas fluorescentes, resulta difícil obtener imágenes de neuronas enredadas en las profundidades del cerebro. Ed Boyden, neurocientífico del MIT, ha creado un método para ampliar los cerebros y hacer más visibles las neuronas fluorescentes situadas en sus profundidades. Utiliza acrilato, que forma una malla densa para mantener el cerebro en su lugar y expandirlo en presencia de agua, inflando así el cerebro uniformemente unas 4.5 veces en cada dirección. Es muy parecido a cómo se expande un pañal al mojarse. Boyden considera que esta «microscopía de expansión puede proporcionar una herramienta clave para cartografiar el cerebro de forma integral, precisa y a escala de circuitos».
Cerebro intacto de ratón adulto antes y después del proceso CLARITY.
Laboratorio Deisseroth
Una de las razones por las que la microscopía de expansión resulta tan útil es que el cerebro puede hacerse transparente antes de ampliarlo varias veces. En 2013, Karl Deisseroth y Viviana Gradinaru, de Stanford, publicaron un método llamado CLARITY que elimina moléculas opacas como las grasas y vuelve transparente el cerebro sin cambiar su forma. Según Thomas Insel, director del Instituto Nacional de Salud Mental de EE. UU., «Este es probablemente uno de los avances más importantes para realizar estudios de neuroanatomía en décadas». Desde que desarrolló CLARITY para los cerebros, Gradinaru ha extendido el método a todos los demás órganos, incluido un ratón entero.
Ambos métodos pueden aplicarse a cerebros modificados genéticamente con proteínas fluorescentes, lo que permite visualizar neuronas en las profundidades del cerebro.
Neuronas de ratón marcadas con GFP.
Wellcome Images, CC BY-NC-ND
En 2008, los tres científicos responsables de extraer la GFP de la medusa y convertirla en una herramienta de uso común en más de un millón de experimentos en todo el mundo recibieron el Premio Nobel de Química número 100. Y en 2014, otros tres científicos recibieron el Premio Nobel por utilizar proteínas fluorescentes para aumentar la resolución de los microscopios ópticos.
Revolucionarias y resistentes
Investigo la fotoquímica y la fotofísica de las proteínas fluorescentes desde que se utilizaron por primera vez en tecnología de obtención de imágenes en 1994; he escrito dos libros sobre ellas y todavía me asombra la gran variedad de usos de esta proteína relativamente sencilla. Quizá no debería sorprenderme que moléculas de ADN plasmídico que codifican GFP hayan sobrevivido a un vuelo espacial: no dentro del cohete, sino en el exterior, donde estuvieron expuestas a temperaturas de 1800F (1000C) y a una fricción intensa. El 53% del ADN colocado deliberadamente dentro de las cabezas de los tornillos de la misión del cohete TEXUS-49 expresó GFP plenamente fluorescente al introducirse en células tras su regreso a la Tierra.
Como las estrellas por la noche, las proteínas fluorescentes llevan 20 años iluminando la ciencia. Y no pasará mucho tiempo antes de que guíen a los cirujanos hacia los crecimientos tumorales durante las operaciones y permitan a los investigadores activar y desactivar procesos biomoleculares seleccionados.
Este artículo se publica en colaboración con The Conversation. La publicación no implica que el Foro Económico Mundial respalde estas opiniones.
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Autor: Marc Zimmer, profesor de Química y decano de Estudios de Connecticut College
Imagen: Múltiples proteínas fluorescentes iluminan las células del tronco encefálico humano. Jeff Lichtman/Universidad de Harvard.
